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[单选题]

建cDNA文库时，首先需分离细胞的核酸部分是( )

A.染色体DNA

B.线粒体DNA

C.总mRNA

D.tRNA

E.rRNA

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发布时间：2022-12-04

更多“建cDNA文库时，首先需分离细胞的核酸部分是（) A．染色体DNA B．线粒体DNA C．总mRNA D．tRNA E．rRNA”相关的问题

第1题

构建基因组DNA文库时，通常需分离细胞的核酸部分是( )

A.染色体DNA

B.线粒体DNA

C.总mRNA

D.tRNA

E.rRNA

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第2题

为了用双杂种系统选出与Ras相互作用的蛋白质，可建立一cDNA文库，在此cDNA文库中cDNA连接在VP16基因片段的C末

端。接着，将此文库转染已含Lex-Ras质粒的酵母细胞，在有XGAL、无组氨酸的平板上生长转化的酵母细胞，并分离蓝色菌落以进行下一步实验。

选择出不含LexA-Ras质粒，仅含VP16-cDNA质粒的“痊愈”细胞，这些细胞可用在缺乏组氨酸的平板上检查是否生长和在有XGAL存在时的显色情况而被挑选出来。那些不能在组氨酸平板上生长和有XGAL存在时形成白色菌落的“痊愈”细胞用LexA-核纤层蛋白质粒转化，并再次在上述平板上测试生长，只有那些在缺乏His的平板上不生长且形成白色菌落(含XGAL)的含LexA-核纤溶蛋白基因质粒的细胞可用于进一步分析。

在1.4×10⁶个原始转化体中仅有19个菌落满足详细分析的严格标准。再测定每种细胞中插入到VP16基因片段的下游的cDNA序列时，将发现：9个菌落(克隆)均有插入的cDNA，均与Raf丝氨酸/苏氨酸激酶的N末端相对应，6个与C-Raf对应，3个与A-Raf对应。

这是一个令人兴奋的发现，因为其他的工作仅能显示Raf的免疫沉淀物可使MAP-激酶磷酸化而激活，如果Raf真能与Ras结合，我们就能找到GTPase单体与MAP-激酶之间的级联中所缺少的一环。

为了验证上述发现所暗示的相互作用是否正确，可构建一些含融合蛋白基因的质粒，如麦芽糖结合蛋白与Raf间的融合蛋白(MBP-Raf)、谷光甘肽-S-转移酶和Ras的融合蛋白(GST-Ras)，之后让这两种融合蛋白质粒在细菌中扩增，在直链淀粉亲和柱上通过它们的混合物检验他们结合的能力，而直链淀粉亲和柱可与MBP-Raf结合。用麦芽糖洗脱被束缚的蛋白质，这时会发现一条明显的GST-Ras蛋白随着MBP-Raf蛋白一起洗脱的曲线。这个结论为双杂交系统的遗传学结论提供了生化证据。

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第3题

建立人胚cDNA文库，已知人胚低丰度mRNA为28000种，占总mRNA的40%，为使低丰度cDNA存在的概率大于99%，此cDNA文

库应包含多少克隆？

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第4题

小鼠胚胎细胞成纤维细胞细胞系10T1/2是一个非常稳定的细胞系，它的细胞以及细胞的行为看起来都与正常成纤维

细胞相似。如果这些细胞在含5'-氮化胞苷的培养基中培养24小时，随后当它们长到很高的密度时，用5'-Azac处理会降低DNA甲基化的正常水平，使原先没有活性的基因活化为开放基因。它们将分化为软骨细胞、肥大细胞和肌肉细胞。如果这些细胞用5'-AzaC处理过后，在低细胞浓度下生长，它们保持原有成纤维细胞的特性，但是当生长许多代后，细胞达到高密度时又会分化。10T1/2细胞如果不曾用5'-氮化胞苷处理过，无论细胞浓度如何都不会引起分化。

当处理过的细胞分化时，大约25%的细胞转变为肌肉细胞(肌原纤维)，肌原细胞形成的高频率导致一种假说的建立，一个独立的主调控基因，它正常情况下由于甲基化受到抑制，它可以启动完整的转化。估计这个基因在用5'-氮化胞苷处理前是处于关闭状态，而在诱导的肌原细胞中呈开放状态。如果这个设想是真的，在用5'-氮化胞苷处理后的mRNA的cDNA拷贝中应能找到与这个用5'-AzaC处理后就开始启动的基因有关的序列。对策是应用一套放射性探针从正常肌原细胞(这种细胞按照你的设想也能表达这个基因)获得的cDNA文库中挑选可能的cDNA克隆。应准备三种放射性探针：

探针1：从5'-氮化胞苷诱导的肌原细胞中分离RNA，制备含放射性的cDNA探针。

探针2：用5'-AzaC处理的肌原细胞中的有放射性的cDNA与未经处理的10T1/2细胞中的RNA进行杂交，除去所有的RNA和DNA杂合体。

探针3：从正常的肌原细胞中分离RNA，制备放射性DNA探针，然后与未经处理的10T1/2细胞中的RNA杂交，除去所有的RNA和DNA杂合体。

第一个探针同cDNA文库中的大多数克隆发生了杂交，但是这些克隆中只有约1%的克隆与探针2或探针3进行杂交。总之，有四种独特的杂交模式(表13-3-54)。

表13-3-54

Class

Probe 1

Probe 2

Probe 3

—

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第5题

在cDNA文库中，分离到两个不同的cDNA克隆，都可以与神经生长因子探针杂交。两个克隆开始区和终止区

序列相同，中间的序列不同。如何解释这个结果？

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第6题

通过差示杂交后制备的cDNA文库使克隆那些只在特定分化细胞中表达基因的概率大为提高。

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第7题

Southern blotting（)

A.主要用于核酸序列分析

B.需要将RNA从琼脂糖凝胶中转移至尼龙膜

C.可用于检测镰刀型细胞贫血基因

D.可用于制备cDNA

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第8题

酵母双杂交系统研究蛋白质相互作用具有如下哪些主要特点和优势( )

A.敏感性高

B.能真实反应细胞内蛋白质间相互作用情况

C.使蛋白质表现型和基因型相联系

D.不需分离靶蛋白

E.可以筛选cDNA文库

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第9题

构建基因组文库时连接方法主要是______；而构建cDNA文库，可用______或______。

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第10题

在构建cDNA文库时，为什么常用GC接尾法而不用AT接尾法连接？

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第11题

你在一种高效的克隆载体λYES（酵母一大肠杆菌中穿梭)中构建了一个cDNA文库，这种载体是由细菌噬菌体λ基因和一

你在一种高效的克隆载体λYES(酵母一大肠杆菌中穿梭)中构建了一个cDNA文库，这种载体是由细菌噬菌体λ基因和一种可在大肠杆菌和酵母中复制的质粒重组而成，它结合了病毒和质粒克隆载体的优点。cDNA可以插入到载体的质粒部分，这样就可以在体外被包装进一个病毒衣壳，包装后的载体感染E.coli比质粒自身更有效，一旦进入E.coli，在λYES中的质粒序列可诱导脱离λ基因组进行重组并可自我复制，这就使cDNA在质粒上与λ分离，这就有利于以后的操作。

为了使克隆效率最大，载体和cDNA均用特殊的方法加以制备，在载体DNA单一独特的XhoI位点切割(5'-CTCGAG)后在dTTP存在下与DNA多聚酶一起孵育，一个制备好的钝端cDNA与一个双链寡核苷酸接头连接，这个接头由两个寡核苷酸5'-CGAGATTTACC和5'-GGTAAATC组成，其5'-末端均有磷酸基团，然后DNA和cDNA混匀并进行连接。这个方案证实非常有效，用2μg载体和0.1mg cDNA，你可以得到4×10⁷重组分子组成的文库。

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