第5题
第6题
克隆文库的构建通常是以一个识别4个碱基序列的限制酶(这些酶切割频率相对较高,平均每256碱基对有1个切点)不完全消化基因组DNA完成的。酶Sau3AI识别序列是5'-\GATC-3'(只写上面一条链,\表示切割位点)。这个位点有一个优点,即Sau 3AI消化片段可被克隆入以BamHI(5'-G\GATC-3')或BglⅡ(5'-A\GATCT-3')消化的载体上。图16-3-17是YFG1基因周围Sau3AI位点的限制性图谱,请列出以Sau3AI完全消化这个片段得到限制性片段的大小,以及不完全Sau3AI消化时产生片段的大小。如果分离一个包含完整YFGl基因的片段,以不完全消化建立文库的重要性在哪里呢?
第7题
你在一种高效的克隆载体λYES(酵母一大肠杆菌中穿梭)中构建了一个cDNA文库,这种载体是由细菌噬菌体λ基因和一种可在大肠杆菌和酵母中复制的质粒重组而成,它结合了病毒和质粒克隆载体的优点。cDNA可以插入到载体的质粒部分,这样就可以在体外被包装进一个病毒衣壳,包装后的载体感染E.coli比质粒自身更有效,一旦进入E.coli,在λYES中的质粒序列可诱导脱离λ基因组进行重组并可自我复制,这就使cDNA在质粒上与λ分离,这就有利于以后的操作。
为了使克隆效率最大,载体和cDNA均用特殊的方法加以制备,在载体DNA单一独特的XhoI位点切割(5'-CTCGAG)后在dTTP存在下与DNA多聚酶一起孵育,一个制备好的钝端cDNA与一个双链寡核苷酸接头连接,这个接头由两个寡核苷酸5'-CGAGATTTACC和5'-GGTAAATC组成,其5'-末端均有磷酸基团,然后DNA和cDNA混匀并进行连接。这个方案证实非常有效,用2μg载体和0.1mg cDNA,你可以得到4×107重组分子组成的文库。