第1题
第2题
第3题
通过分析一个类似增强子元件(SRE血清反应元件)的一系列缺失突变体,发现在转录起始点上游的300核苷酸序列对于在加入血清后增强转录是必需的。通过建立包含有人β-球蛋白部分基因(它编码一个极为稳定的mRNA)的各种杂交基因来研究c-fos mRNA的稳定性。球蛋白基因的结构和两种杂交基因如图13-3-60(1)B、C、D所示。在低血清浓度下,当杂交基因转染鼠细胞时,24小时后它才对血清作出反应(图13-3-60(2)B、C所示)。
第4题
第6题
当处理过的细胞分化时,大约25%的细胞转变为肌肉细胞(肌原纤维),肌原细胞形成的高频率导致一种假说的建立,一个独立的主调控基因,它正常情况下由于甲基化受到抑制,它可以启动完整的转化。估计这个基因在用5'-氮化胞苷处理前是处于关闭状态,而在诱导的肌原细胞中呈开放状态。如果这个设想是真的,在用5'-氮化胞苷处理后的mRNA的cDNA拷贝中应能找到与这个用5'-AzaC处理后就开始启动的基因有关的序列。对策是应用一套放射性探针从正常肌原细胞(这种细胞按照你的设想也能表达这个基因)获得的cDNA文库中挑选可能的cDNA克隆。应准备三种放射性探针:
探针1:从5'-氮化胞苷诱导的肌原细胞中分离RNA,制备含放射性的cDNA探针。
探针2:用5'-AzaC处理的肌原细胞中的有放射性的cDNA与未经处理的10T1/2细胞中的RNA进行杂交,除去所有的RNA和DNA杂合体。
探针3:从正常的肌原细胞中分离RNA,制备放射性DNA探针,然后与未经处理的10T1/2细胞中的RNA杂交,除去所有的RNA和DNA杂合体。
第一个探针同cDNA文库中的大多数克隆发生了杂交,但是这些克隆中只有约1%的克隆与探针2或探针3进行杂交。总之,有四种独特的杂交模式(表13-3-54)。
表13-3-54 | |||
Class | Probe 1 | Probe 2 | Probe 3 |
A B C D | + + + + | — — + + | — + — + |
第9题
第10题
第11题
有人建议用PCR扩增同该蛋白质结合的微量DNA,思路是(图Q25.8):①合成一组长为26个碱基的随机序列的寡聚核苷酸混合体,在该序列的两侧各有一段25个碱基的序列作为PCR扩增的引物位点[图Q25.8(a)];②把这些寡聚核苷酸加到含有转录因子的细胞粗提取物中,转录因子可以同含有结合位点的寡聚核苷酸结合;③用转录因子特异的抗体分离同转录因子结合的寡聚核苷酸;④用PCR扩增选择到的寡聚核苷酸进行序列分析。
图Q25.8 用随机的寡聚核苷酸选择和扩增特异的DNA序列(a)用于选择的原初随机序列的寡聚核苷酸,N代表任何一种核苷酸;EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点有利于选择DNA的克隆和序列分析。(b)同序列特异的DNA结合蛋白结合的寡聚核苷酸的选择和序列分析方案按照这一思路,用0.2ng单链随机序列的寡聚核苷酸开始了这项实验,这个寡聚核苷酸可以同一个PCR引物结合成部分双链,经过如图Q25.8(b)所示的四轮选择和复制后,用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ消化分离到的DNA,将片段克隆到质粒中,并测定了10个独立的克隆(表Q25.1),问:
表Q25.1 10个克隆的序列
注:画线的序列是PCR引物部位,两种序列都是从BamH Ⅰ末端开始,所有序列中结合位点的方向都是相同的。