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[主观题]

当一个DNA结合蛋白同它识别的核苷酸序列结合以后，就保护了它们的磷酸二酯键免遭切割，其结果，电泳胶上就有明

显可见的空缺带(与对照相比)，这就是DNA足迹法。

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发布时间：2022-12-04

更多“当一个DNA结合蛋白同它识别的核苷酸序列结合以后，就保护了它们的磷酸二酯键免遭切割，其结果，电泳胶上就有明”相关的问题

第1题

由酵母交配型基因座产生的关键调控蛋白之一是一个抑制蛋白，称做α2。在可交配型的单倍体细胞中，α2对于关闭一

由酵母交配型基因座产生的关键调控蛋白之一是一个抑制蛋白，称做α₂。在可交配型的单倍体细胞中，α₂对于关闭一系列涉及到交配型特异性的基因是必需的。在α₂二倍体细胞中，α₂抑制物同α₁基因产物协同作用，关闭了除α特异性基因外的一系列单倍体特异性的基因。两类有区别又相互关联的保守DNA序列在这两套控制基因的上游被发现，一个在单倍体特异性基因前，另一个在α特异性基因前。根据这些上游序列的相关性，很有可能α₂与两者都结合。然而，它的结合特性在它能识别单倍体特异性基因前必须通过α₁蛋白以某种方式进行修饰。至此，这种修饰作用的本质是什么？α₁是能催化α₂的共价修饰，还是能与α₂结合而修饰α₂蛋白？

为了认清这些问题，要做三个实验。首先，在单独作用和共同作用两种方式下，测定α₁和α₂与两种上游调控DNA位点的结合(图13-3-50所示)。α₁单独不能同含有任何调控位点的DNA片段结合。然而α₂虽能与α专一性片段结合，但是不能同单倍体专一性片段结合。α₁和α₂的混合物同两者都能结合。

在第二个实验中，大量的含α专一性序列的未标记DNA加入到α₁和α₂蛋白的混合物中。在这样的条件下，单倍体专一性片段仍被束缚。同样，如果加入过量的含有单倍体专一性片段的未标记DNA到混合物中，α专一性片段仍然被束缚。

在第三个实验中，改变不同的α₁和α₂的比例，当α₂过量时，同单倍体专一性片段的结合减弱，而当α₁过量时，同α专一性片段的结合减弱。

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第2题

一个癌基因，从序列上看似乎编码一个转录因子。当放在细胞中表达时，该基因的产物是完全不溶的，这影响了对其功

能的直接检测。免疫染色表明，这种蛋白质定位于细胞核内，如同推测的一样，是一种转录因子。如果能够测出它所结合的DNA序列，就可以从现有的序列资料中查找已知基因启动子的天然位点，从而能够找到它所调节的基因。

有人建议用PCR扩增同该蛋白质结合的微量DNA，思路是(图Q25.8)：①合成一组长为26个碱基的随机序列的寡聚核苷酸混合体，在该序列的两侧各有一段25个碱基的序列作为PCR扩增的引物位点[图Q25.8(a)]；②把这些寡聚核苷酸加到含有转录因子的细胞粗提取物中，转录因子可以同含有结合位点的寡聚核苷酸结合；③用转录因子特异的抗体分离同转录因子结合的寡聚核苷酸；④用PCR扩增选择到的寡聚核苷酸进行序列分析。

图Q25.8 用随机的寡聚核苷酸选择和扩增特异的DNA序列(a)用于选择的原初随机序列的寡聚核苷酸，N代表任何一种核苷酸；EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点有利于选择DNA的克隆和序列分析。(b)同序列特异的DNA结合蛋白结合的寡聚核苷酸的选择和序列分析方案按照这一思路，用0.2ng单链随机序列的寡聚核苷酸开始了这项实验，这个寡聚核苷酸可以同一个PCR引物结合成部分双链，经过如图Q25.8(b)所示的四轮选择和复制后，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ消化分离到的DNA，将片段克隆到质粒中，并测定了10个独立的克隆(表Q25.1)，问：

表Q25.1 10个克隆的序列

注：画线的序列是PCR引物部位，两种序列都是从BamH Ⅰ末端开始，所有序列中结合位点的方向都是相同的。

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第3题

你已经建立了一个体外转录系统。使用一个已知的DNA片段，它可在一个病毒启动子的控制下被转录。当在系统中加入

纯化的RNApolⅡ、TFⅡD(TATA结合因子)和TFⅡB、TFⅡE(与RNA聚合酶结合)后，DNA开始被转录。然而，体外转录系统的低效率暗示可能有一个额外的调控序列与转录因子结合，而这种转录因子在纯化的组合当中并不存在，为了寻找与这个被推测的调控因子结合的DNA序列。你做了一系列在转录起始点上游的缺失(如图13-3-44B所示)，比较它们在纯化系统中及在细胞粗提物中的转录活性。作为内部控制，你将每种缺失体与一个能产生生长转录本的未缺失的模板混合(如图13-3-44A)。这些分析的结果(图13-3-44C)显示，一直缺失到-61，对转录仍无影响，而-11的缺失在两种系统中都会使转录受到抑制。使人惊奇的是一50位的缺失体可以像未损失的模板一样在纯化系统内进行有效的转录。但是在细胞粗提物中却没有这种作用。

你纯化了与这种效应有关的蛋白，显示它使非缺失的模板及-61缺失的模板转录都增强了10倍，面对-50缺失的模板无激活作用，印迹分析表明这个因子同一个TATA位点上游的特殊的短序列相结合，虽然这种因子在TFⅡD缺乏时同它的结合位点的结合是短暂的，但当TFⅡD存在时，它可与结合位点稳定地结合。

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第4题

亮氨酸拉链蛋白所识别的DNA有何特点？如何理解亮氨酸拉链转录因子的二聚体结构同识别位点的关系？

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第5题

特殊转录因子的纯化给人带来很多困难，因为分析速度慢，并且转录因子本身不稳定，当你鉴定出你所需片段时，这个

因子通常已经失活。你可以想出一个极好的方法以加快分析速度。你可以合成一段不含胞嘧啶核苷酸的DNA序列，将这段序列放到启动子后在一适当反应混合物中温育，这个启动子将指导不含鸟嘌呤核苷酸的转录本的合成，如果不加GTP，只产生一定长度的RNA转录本，这个RNA转录本来自于合成的DNA序列。因为其他转录本都在需G处被终止。如果你能使这个想法得到实现，则快速分析特殊序列的转录仅通过测量标记核苷酸的放射性就可实现。

为了验证你的想法，你构建两个携带合成DNA的质粒。一个具有腺病毒的启动子(PmL1)，另一个无启动子(PC1)。把两种质粒同纯化的RNApolⅡ、纯化好的转录因子样品及³²P-CTP混合，除此之外，再加入各种组合的GTP、RNaseT1(可以切开RNA与G的连接)和3'-氧甲基GTP(无论何时它参入正在形成的链，它就会终止转录)，通过凝胶电泳测定结果如图13-3-42所示。

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第6题

DNA结合蛋白在0.01mol/L的NaCl中和双链DNA微弱地结合，在1mol/LNaCl溶液中结合却很强，而且它只和特殊的碱基

序列结合，该蛋白的什么特征可能说明盐浓度的这种效应？

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第7题

在E．coli中，通过RNA pol同_________的结合起始转录，与转录起点碱基互补的NTP同_________亚基结合

，然后是第二个NTP通过与第一个NTP形成_________磷酸二酯键而结合上。当生成的RNA链约有12个核苷酸长度时，_________亚基脱离RNApol，RNA链在_________的作用下继续延伸，当RNA pol在DNA链上遇到_________信号时，转录作用停止。

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第8题

关于DNaseI足纹分析法，下列说法不正确的是A．DNaseI可以随机水解核苷酸中的磷酸二酯键B．DNaseI可

关于DNaseI足纹分析法，下列说法不正确的是

A．DNaseI可以随机水解核苷酸中的磷酸二酯键

B．DNaseI可以水解与蛋白质结合的核苷酸

C．DNaseI水解核苷酸有碱基特异性

D．末端标记的双链DNA经DNaseI作用，经放射自显影后形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA探针

E．当结合有蛋白质的DNA片段DNase工作用后，在放射自显影图谱上出现一段空白区域，称之为足纹

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第9题

在构建cDNA克隆之前，可以用______来富集一特殊的核苷酸序列。做法是：用来自于能够产生目的蛋白的细胞mRNA分

子同来自于另一类型细胞(不产生这种蛋白质，但亲缘关系密切)的过量mRNA分子杂交。

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第10题

HLH蛋白（)。A．在序列组成上与原核生物螺旋-转角-螺旋蛋白具有相似性B．通过环区与DNA结合C．形

HLH蛋白()。

A．在序列组成上与原核生物螺旋-转角-螺旋蛋白具有相似性

B．通过环区与DNA结合

C．形成两个α-螺旋与DNA的大沟结合

D．形成两性螺旋，其中疏水残基位于螺旋的一侧

E．以上都不是

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第11题

c-fos基因是FBJ鼠骨肉瘤病毒所携带的癌基因的细胞内同源基因。它的功能未知，c-fos的激活是对于生长因子的最

早的转录反应之一。在小鼠细胞中，c-fos的转录水平在5min内显著增加，在10～15min时达最大值之后突然下降。为了研究人类c-fos基因的瞬时诱导的机制，可以克隆一个DNA片段，它含有全长的转录单元，这个转录单元起始于转录起始点上游-750bp处，终止于+1.5kb的poly(A)加入位点(图13-3-60(1)A)。当把这个克隆转至小鼠细胞中时(我们可以较为容易区分克隆与内源性c-fos基因的mRNA)，一天后加入血清(富含生长因子)刺激细胞生长。你发现同样的瞬时诱导(图13-3-60(2)A)。尽管与小鼠基因相比，时间上有略微的延长。

通过分析一个类似增强子元件(SRE血清反应元件)的一系列缺失突变体，发现在转录起始点上游的300核苷酸序列对于在加入血清后增强转录是必需的。通过建立包含有人β-球蛋白部分基因(它编码一个极为稳定的mRNA)的各种杂交基因来研究c-fos mRNA的稳定性。球蛋白基因的结构和两种杂交基因如图13-3-60(1)B、C、D所示。在低血清浓度下，当杂交基因转染鼠细胞时，24小时后它才对血清作出反应(图13-3-60(2)B、C所示)。

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