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[主观题]

你纯化出经BamHI消化重组质粒DNA所得的两个DNA片段,其中一个长为400bp,另一个长900bp,你想要如图16-3-20(1)

你纯化出经BamHI消化重组质粒DNA所得的两个DNA片段,其中一个长为400bp,另一个长900bp,你想要如图16-3-20(1)所示将它们连接起来产生一个杂合基因,如果你的推测是正确的话,就会得到令人惊奇的新物质。

你纯化出经BamHI消化重组质粒DNA所得的两个DNA片段,其中一个长为400bp,另一个长900b

你在DNA连接酶存在情况下将两种片段混合在一起并且进行孵育,30分钟后和8小时后,你取一些样品进行琼脂糖凝胶电泳分析,你惊讶地发现连接得到了一系列复杂的DNA片段而不是所需的1.3kb小片段,并且发现孵育时间越长,小片段浓度越低而大片段浓度增加,如果你用BamHI切割连接后的重组体,你会重新获得开始的两片段(图16-3-20(2)A)。

你纯化出经BamHI消化重组质粒DNA所得的两个DNA片段,其中一个长为400bp,另一个长900b

令人吃惊的是,你将从琼脂糖凝胶中纯化得到的1.3kb片段用BamHI消化,检查它的结构,与预想的一样,可以得到最初的两片段(图16-3-20(2)B)。这就可以确定这是你所需的结构。但是,你用EcoRl消化另一份样品,你希望通过消化得到300bp的片段和700bp的片段,但你跑的电泳是一系列DNA片段(图16-3-20(2)B)。

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第1题

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质粒pBR607DNA是双链环状的,分子量为2×106U。这个质粒带有两个基因,它们所编码的蛋白质产物使宿主细菌对四环素和氨苄青霉素具有抗性(Tet-r和Amp-r)。该DNA对下列限制酶只有一个识别部位:EcoRI、BamHI、HindⅢ、PstI和SaII。将DNA克隆到EcoRI部位并不影响对两种药物的抗性。将DNA克隆到BamHI、HindⅢ和SaII部位则破坏四环素抗性。克隆到PstI部位破坏氨苄青霉素抗性。用下列限制酶混合物消化可得到如表16-2-10所列的片段。试在限制酶图上标出相对于EcoRI切点的PstI、BamHl、HindⅢ和SalI的切点。

表16-2-10

酶混合物片段分子量(×106U)
EcoRI,PstI

EcoRl,BamHI

EcoRI,HindⅢ

EcoRI,SalI

EcoRI,BamHI,PstI

0.64.2.14

0.2.2.4

0.05.2.55

0.55.2.05

0.2.0.64.1.94

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第2题

质粒pHUBI DNA是双链环状,长5.7kb(5.7×103个碱基对)。这个质粒带有某基因,它的蛋白质产物使宿主细菌对四环素

质粒pHUBI DNA是双链环状,长5.7kb(5.7×103个碱基对)。这个质粒带有某基因,它的蛋白质产物使宿主细菌对四环素具有抗性(Tet-r)。该DNA对下列每种限制酶具有一个识别位点:EcoRI、HpaI、BamHI、PstI、SalI、BglII。在BarnHI和SalI位点处克隆会破环四环素抗性;在其他酶的位点处克隆则保留四环素抗性。用各种限制酶以及酶混合物消化可得到如表16-2-11所列的DNA片段。试在pHUBIDNA图上标出所有这些酶的切点。将DNA图画成环形,在圆周上以5.7kb总长标出刻度。

表16-2-11

酶混合物片段长度(kb)
EcoRI

EcoRI,BamHI

EcoRI,HpaI

EcoRI,SalI

EcoRI,BglII

EcoRI,PstI

PstI,BglII

BglII,HpaI

5.7

0.4,5.3

0.5,5.2

0.7,5.0

1.1,4.6

2.4,3.3

1.3,4.4

0.6,5.1

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第3题

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用一种限制性内切核酸酶消化某大型的环状质粒DNA。得到的片段随机重装配(即片段不再按原来顺序排列),选择与原来质粒分子量相同的环状分子。然后用由这些片段组成的分子感染不含质粒的宿主细胞。

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第4题

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酵母的两种不同的环状质粒DNA载体(YP1和YP2)用于将leu-转化成leu+,从这两种质粒转化获得的leu+培养物,都能与leu-表型的细胞交配。

YP1leu+×leu-→所有的子代表型都是leu+,所有子代的DNA都能与YP1特异探针显示阳性反应;

YP1leu+×leu→一半的子代为leu+,能够与YP2特异的探针杂交,另一半为leu-,不能与YP2特异探针杂交。

解释这两种不同质粒转化造成的差异。

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第5题

特殊转录因子的纯化给人带来很多困难,因为分析速度慢,并且转录因子本身不稳定,当你鉴定出你所需片段时,这个

因子通常已经失活。你可以想出一个极好的方法以加快分析速度。你可以合成一段不含胞嘧啶核苷酸的DNA序列,将这段序列放到启动子后在一适当反应混合物中温育,这个启动子将指导不含鸟嘌呤核苷酸的转录本的合成,如果不加GTP,只产生一定长度的RNA转录本,这个RNA转录本来自于合成的DNA序列。因为其他转录本都在需G处被终止。如果你能使这个想法得到实现,则快速分析特殊序列的转录仅通过测量标记核苷酸的放射性就可实现。

为了验证你的想法,你构建两个携带合成DNA的质粒。一个具有腺病毒的启动子(PmL1),另一个无启动子(PC1)。把两种质粒同纯化的RNApolⅡ、纯化好的转录因子样品及32P-CTP混合,除此之外,再加入各种组合的GTP、RNaseT1(可以切开RNA与G的连接)和3'-氧甲基GTP(无论何时它参入正在形成的链,它就会终止转录),通过凝胶电泳测定结果如图13-3-42所示。

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第6题

四膜虫(Tetrahymena)是一种有两个胞核的有纤毛原生动物,小胞核(micronucleus)具有细胞染色体的主拷贝,其参

四膜虫(Tetrahymena)是一种有两个胞核的有纤毛原生动物,小胞核(micronucleus)具有细胞染色体的主拷贝,其参与有性接合,但不参与日常基因的表达。大胞核(macronucleus)是一种由很多大小基因双链DNA片段形成的细胞基因组的“工作”拷贝(小染色体-minichromosomes),其参与基因转录,小染色体的许多拷贝中都有核糖体RNA的基因。可用梯度离心将其与其他小染色体分离,以进行进一步的研究。

通过电镜检测发现每个含核糖体基因小染色体为线性结构,长21kb。用琼脂糖凝胶电泳观察其仍为21kb(图16-3-24,泳道1)。如果用限制酶BglⅡ酶切小染色体,产生的两个片段13.4和3.8kb加起来不到21kb(图16-3-24,泳道2)。用其他限制酶酶切DNA,所得片段大小加起来仍旧不足21kb,而且每一种消化所产生的片段大小之和均不同。

如果未切割的小染色体在跑电泳之前先经过变性退火,那么21kb片段将被切割成正好是其一半的10.5kb。用双链片段代替(图16-3-24,泳道3),相似地,如果BglⅡ切割过的小染色体经变性和退火,则13.4kb片段将被其一半大小的6.7kb双链片段代替(图16-3-24,泳道4)。

请解释为什么限制酶切割下的片段加起来不是21kb?为什么经变性退火后其电泳形式就发生改变?你认为核糖体小染色体的序列是什么样的?

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第7题

假定你想给怀疑论者证实转化作用是由DNA而不是由蛋白质引起的,你得不到纯酶来降解DNA或蛋白质。但是,通过你
的大量工作,已经确定:①50种不同的基因特性能被转化;②转化的效率很低,并高度依赖于DNA浓度。你惟一拥有的非微生物实验室仪器是制备型离心机,可以用它测定DNA的分子量,并按分子量分级分离DNA。试设计一个简单的实验证明转化因子是DNA。提示:可考虑连锁作用。
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第8题

平滑肌肌浆球蛋白并不像骨骼肌中的肌浆球蛋白。它只在它的轻链磷酸化后才与肌动蛋白相互作用。磷酸化过程由胞
内Ca2+浓度的变化来控制,而Ca2+又是由钙调素(CaM)介导的。你已从平滑肌中纯化出肌浆球蛋白轻链激酶。但此激酶在有或无Ca2+存在时活性是一样的。你也可以加入蛋白酶抑制剂来保证纯化过程中激酶的完整性。在此条件下抽提物中的激酶元活性,除非有Ca2+存在。

表14-3-14 蛋白酶抑制剂对纯化肌动蛋白轻链激酶活力的影响

纯化表格加入的试剂混合物相对活力
负型抑制剂没有50
负型抑制剂Ca2+50
负型抑制剂钙调素50
负型抑制剂Ca2+/钙调素50
正型抑制剂没有1
正型抑制剂Ca2+1
正型抑制剂钙调素1
正型抑制剂Ca2+/钙调素100

通过凝胶过滤和离子交换层析部分地纯化激酶,接着在Ca2+存在下通过钙调素亲和柱。使人高兴的是,所有有活性的激酶均粘在柱子上,并且当用Ca2+螯合剂EDTA洗脱时能定量地洗脱下来。根据表14-3-14所示,纯化酶现在像所希望的那样,这表明了酶绝对依赖于Ca2+/钙调素。在此基础上,你可直接通过钙调素亲和柱挽救最初纯化的酶样品。令人惊奇的是激酶直接通过柱子,不论Ca2+存在与否。

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第9题

你正在研究一种在感染周期后期产生一套丰富蛋白质的DNA病毒。其中一种蛋白的mRNA被定位于线状基因组中部的一
个限制性片段。为确定精确位置,你将mRNA与纯化了的限制性片段退火,环境中具有DNA与RNA稳定杂交的双链,DNA两条链不能重新退火。电镜下检查退火的双链,结构如图8-3-28所示。在RNA/DNA杂合双链的末端为什么会有单链尾巴?

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第10题

原核细胞最基本的特点是()

A.遗传信息量小

B.遗传信息载体仅由一个环状DNA构成

C.遗传信息载体由多个环状DNA构成

D.细胞内没有分化出以膜为基础的具有专门结构和功能的细胞器和细胞核

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第11题

质粒是细菌染色体上的一段DNA。()
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